Лекции по курсу «Эпигенетическая регуляция экспрессии генов эукариот»

Лекции по курсу «Эпигенетические механизмы регуляции экспрессии генов»

Колесникова Татьяна Дмитриевна

engrailed@ngs.ru, trotsenko@mcb.nsc.ru

Иванов Михаил Константинович

imk@ngs.ru

Лекции Колесниковой 2015 года в том виде, как они читались, тут:

https://www.dropbox.com/sh/q0518ze17bdqtzf/AAD76cA_mnlWXNXFpqSgQP_Ea?dl=0

Ближе к экзамену постараюсь разбить по темам.

видео и презентация с лекции «Эпигенетика. Новая парадигма?» в ИциГ тут:

http://icg.nsc.ru/lectures/

Программа курса (2014 год)

Программа за 2015 год будет значительно меняться только по последним лекциям (некодирующие РНК)

Введение

Что такое эпигенетика? Общие представления.

«История» открытия эпигенетических механизмов, современные направления науки, называемой «эпигенетика».

Общий обзор механизмов, обеспечивающих дифференциальную экспрессию генов.

Консервативность эпигенетических механизмов у эукариот (обобщить по всем лекциям)

Структура нуклеосомы

Структура коровых гистонов

Взаимодействие ДНК – нуклеосома. Зависимость от нуклеотидной последовательности. Особенности распределения нуклеосом в геномах. Методы изучения локализации нуклеосом в ДНК in vivo.

Варианты гистонов

Варианты гистона Н3: H3.3 - маркер для транскрипционо-активных районов, CenpA – центромерный вариант гистона H3.

Варианты гистона Н2А: H2AX (gH2AX), H2AZ, MacroH2A

Пост-трансляционные модификации гистонов

Ацетилирование лизина (K)

AcH3K9

AcH4K16

AcH4K5, AcH4K12 - маркеры вновь синтезированных гистонов

Метилирование лизина (K) и аргинина (R)

2MeH3K9, 3MeH3K9 - маркеры HP1-зависимого гетерохроматина

3MeH3K27 - маркер Polycomb-зависимого хроматина

3MeH3K4 - маркер активной транскрипции

Фосфорилирование серина (S) и треонина (T)

phos-H3S10 роль в активации транскрипции и в митозе

H2AXS139ph (Gamma-H2AX) в репарации двуцепочечных разрывов в ДНК

Другие модификации гистонов: убиквитинирование, сумоилирование, полиАДФ-рибозилирование

Роль пост-трансляционных модификаций гистонов

Изменение электростатического взаимодействия между гистонами и ДНК. Изменение сродства к различным белкам. Молекулярные метки.

Модификации гистонов и теория “гистонового кода”. Домены белков, распознающие метилированные лизины, ацетилированные лизины, фосфорелированные серины

Методы изучения распределения белков в хроматине. Иммунопреципитация хроматина.

Сборка-разборка нуклеосом. Гистоновые шапероны. Разнообразие гистоновых шаперонов по структуре и функци. Шапероны CAF1, Asf1, HIRA

Механизмы наследоваеия «гистонового кода» в процессе репликации

Проблема снижения концентрации эпигенетических маркеров в хроматине после репликации.

Взаимодействие между молекулярными метками.

Время репликации в S-фазе как механизм эпигенетического наследования.

Поздняя репликация в S-фазе – способ наследования «молчащего» состояния.

Бимодальная система ацетилирования димеров H3—H4 в репликационной вилке.

«Дозревание хроматина» на разных этапах клеточного цикла

Наследование гистоновых вариантов

Круговорот гистонов и стабильность эпигенетических меток

Кратковременные и локальные метки в хроматине

Особенности хроматина в окрестностях промоторов (см. лекцию про проект ENCODE и сравнение хроматина у человека-дрозофилы-нематоды. Там гораздо больше и интереснее)

Модификации хроматина в ответ на двуцепочечные разрывы в ДНК (DSB)

АТФ-зависимый ремоделингхроматина

Классификация АТФаз, входящих в состав комплексов ремоделинга

Структура комплексов ремоделинга

Разнообразие функций комплексов ремоделинга.

Уровни организации хроматина.

Первичныя, вторичная и третичная структуры хроматиновой фибриллы.

Различные модели вторичной структуры хроматиновой фибриллы (30 нм фибрилла)

Роль межнуклеосомных взаимодействий в упаковке хроматиновой фибриллы. Роль гистоновых хвостов, acidic patch

Роль гистона Н1

Третичная структура хроматиновой фибриллы. Предполагаемая роль белков HP1 и других структурных хроматиновых белков.

Петлевая организация хроматина.

Типы хроматиновых петель.

Ядерный матрикс. Определения, состав, методы выделения.

Наследование пространственной организации ядра. Роль цис- и транс-факторов.

Поведение различных компонентов хроматина во время митоза

Энхансеры и инсуляторы

Энхансеры - основное средство регуляции транскрипции в клетках высших эукариот.

Организация и механизмы работы энхансеров

Организация и механизмы работы инсуляторов. Особенности инсуляторов у дрозофилы и у млекопитающих

Белок CTCF – консервативный инсуляторный белок, главный инсуляторный белок у позвоночныхх.

Участие когезина в стабилизации 3D организации хроматина

Роль инсуляторов в 3D организации геномов

Метды картирования 3D взаимодействий в ДНК. Метод 3С (chromatin conformation capture). Метод Hi-C.

Топологические домены и границы между ними

Специфические для разных клеточных типов внутрихромосомные взаимодействия в бета-глобиновом локусе мыши, обусловленные CTCF.

A switch between topological domains underlies HoxD genes collinearity in mouse limbs

Гены глобинов – классические модельные объекты регуляции экспрессии эукариотических генов

Общее представление о более сложных регуляторных элементах в геномах. Active Chromatin Hub и Locus Control Region на примере регуляции глобиновых генов.

Сложные регуляторные элементы, включающие энхансеры, инсуляторы и сайленсеры на примере регуляторной зоны BX-C комплекса дрозофилы

Хроматин и регуляция активности генов

Разные уровни регуляции, на которых участвуют изменения структуры хроматина: регуляция отдельных генов, регуляция протяженных локусов хромосом, регуляция на уровне целой хромосомы.

Хроматин при локус-специфической репрессии генов

Репрессия генов с помощью H3K9Me2/3 и HP1. Репрессия генов плюрипотентности при дифференцировке стволовых клеток.

Временные локальные изменения хроматина в окрестностях промотора на примере генов, участвующих в репликации. Глубокая репрессия этих генов при выходе из клетки из клеточного цикла.

Репрессия генов с помощью H3K27Me3 и Pc

Эпигенетическая репрессия-активация на примере регуляции генов раннего развития, обеспечиваемой белковыми комплексами Polycomb и Tritorax.

Структура комплексов PcG. PRC1 (Polycomb Repressive complex 1). PRC2 (Polycomb Repressive complex 2).

Структура комплексов Trx. TAC1 (Tritorax activating complex 1). BRM (Комплекс ремоделинга. Включает Brahma АТФазу)

Механизмы действия комплексов PcG и TrxG. Polycomb/Tritorax response elements

Роль lncRNA.

Бивалентный хроматин H3K4Me3/H3K27Me3 – хроматин, характерынй для генов реннего развития, обнаруживаемый в эмбриональных стволовых клетках.

Эволюционная консервативность Polycomb сайленсинга.

Формирование протяженных доменов репрессированного или активного хроматина

Примеры протяженных хроматиновых доменов: H3K9Me2/3 хроматин, деацетилированный хроматин у S. Cerevisiae, H3K27Me3 хроматин, инактивация Х-хромосомы у млекопитающих, активация Х-хромосомы у самцов дрозофилы.

Как происходит инактивация протяженных участков хромосом? Нкулеация, спрединг (распространение) и терминация.

Белок-зависимые и РНК-зависимые механизмы инициации сборки гетерохроматина.

Пример белок-зависимого механизма – инициация сборки деацетилированного хроматин у S. сerevisiae.

Пример РНК-зависимого механизма инициации сборки гетерохроматина – формирование прицентромерного гетерохроматина у Schizosaccharomyces pombe.

Распространение вдоль по хромосоме НР1-зависимого хроматина.

Распространение вдоль по хромосоме SIR-зависимого хроматина у S. сerevisiae.

Механизмы остановки распространения гетерохроматина

Эпигенетика и эпигеномика

Идентификация сайтов связывания хроматиновых белков посредством ДНК-аденин-метилтрансферазы Dam Identification (DamID) [van Steensel et al., 2001 Nat Genet]

Модель «пятицветного» хроматина у дрозофилы (по статье Filion et al., 2010)

Проект ModENCODE и «многоцветные» модели хроматина дрозофилы

Проект ENCODE, модель «многоцветного» хроматина человека. Выделение разных типов хроматина, которые соответствуют следующим участкам генома: элементам, обогащенным CTCF; предсказанным энхансерам; предсказанным областям, фланкирующим промоторы; предсказанным репрессорам и областям с низкой генной активностью; предсказанным промоторам, включая TSS; предсказанным областям транскрипции; предсказанным слабым энхансерам и другим цис-регуляторным элементам с открытым хроматином.

NATURE | VOL 512 | 28 AUGUST 2014 Объединение данных проектов ENCODE и ModEncode. Сравнительный анализ разных типов хроматина у трех видов: дрозофила, нематода, человек.

Геномный анализ пространственно-временной картины репликации (Replication Timing). Репликационный тайминг как эпигенетическая характеристика клетки.

Особенности организации хромосом млекопитающих. R/G диски, Изохоры. Репликационные домены. Компартменты открытого и закрытого хроматина.

Районы «открытого» и «закрытого» хроматина на примере локусов генов альфа-глобинов и бета-глобинов человека.

Некоторые подходы к работе с данныим, полученными в рамках геномных проектов. Браузер UCSC http://genome.ucsc.edu/

Там, где не работают геномные подходы. Анализ на уровне индивидуальных клеток. Новые подходы в микроскопии. (тема почти не раскрыта. Надо бы раскрыть в следующем году)

Метилирование ДНК и его роль в регуляции экспрессии генов

Метилирование ДНК как пример направленной ковалентной модификации ДНК.

Распространение модифицированных оснований у разных организмов.

Продукты ферментативного процессинга m5C.

Высокая мутабильность ДНК, несущей метилированные цитозины.

ДНК-метилтрансферазы (DNMT). DNMT поддерживающие, метилирующие de novo

ДНК-метилтрансферазы высших позвоночных: Dnmt1: поддерживающая метилаза

Dnmt3a/b: de novo метилазы. Эволюция 5C-DNMTs

Белки, распознающие метилированный и не метилированный цитозины и белковые домены, ответственные за это распознавание.

Эффекты метилирования CpG на регуляцию экспресии генов

Взаимодействие метилирования ДНК с системами метилирования, ацетилирования и убиквитинирования гистонов.

Деметилирование ДНК

Распределение метилирования ДНК в геноме млекопитающих и его динамика в жизненном цикле. Распределение метилирования ДНК в геноме человека. CpG островки. Разные типы промоторов и способы их регуляции. Волны глобального метилирования и деметилирования ДНК. Геномный импринтинг. Нарушения метилирования при канцерогенезе.

Функции метилирования ДНК.

Некоторые патологии, связанные с нарушением метилирования

Наследование ON или OFF состояния гена в течение нескольких поколений организмов у многоклеточных. Мыши Agouti viable yellow – уникальная модель эпигенетического наследования метилирования ДНК следующему поколению.

Метилирование ДНК: подходы к анализу

Methyl Acceptance Assay Используется для сравнительной оценки общего уровня метилирования

Основные подходы к сайт-специфичному анализу метилирования ДНК

• Метил-чувствительные рестриктазы

• Распознавание антителами или специфическими белками (ChIP)

• Наиболее широко используемый подход для изучения метилирования ДНК -

Бисульфитная конверсия (модификация бисульфитом Na: превращение неметилированного цитозина в урацил)

Что такое гетерохроматин?

Факультативный гетерохроматин – «гетерохроматин как состояние», конститутивный гетерохроматин – «гетерохроматин как вещество».

Конститутивный гетерохроматин

Определение через свойства: компактное состояние, поздняя репликация, обогащенность повторенными последовательностями ДНК, обедненность генами, низкая частота рекомбинации, окраска С-методом, способность вызывать эффект положения

Состав ДНК конститутивного гетерохроматина

Высокоповторенная ДНК – сателлиты, умеренноповторенная ДНК -
МГЭ и другие повторы, уникальная ДНК – гетерохроматиновые гены.

Исторически сложившиеся представления о гетерохроматине их уточнения с современной точки зрения.

Функции конститутивного гетерохроматина: поддержание центромеры; поддержание теломеры; защита повторов от рекомбинации; создание ядерного компартмента, который участвует в репрессии некоторых генов; инактивация транскрипции повторенных последовательностей (потенциальная опасность). Регуляция экспрессии генов? Депо белков?

Программа подраздела “КОРОТКИЕ НЕКОДИРУЮЩИЕ РНК И РЕГУЛЯЦИЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ ЭУКАРИОТ»

РНК-интерференция – открытие, принцип, основные свойства и механизмы.

Транскрипционный (TGS) и постранскрипционный (PTGS) генетический сайленсинг. Открытие PTGS у растений. Особенности PTGS, выявленные в конце XX в. Открытие РНК-интерференции у C.elegans. C.elegans – удобный, но не универсальный объект для изучения механизмов РНК-интерференции.

Разнообразие разновидностей малых регуляторных РНК, принципы их классификации, особенности процессинга.

SiРНК и miРНК. PiРНК – особенности процессинга и функции. TasiРНК.

Биологические активности малых регуляторных РНК. Варианты взаимодействия малых регуляторных РНК со своими мишенями.

Малые некодирующие РНК как молекулярные зонды, привлекающие к мишеням белковые комплексы. Возможности участия комплексов, содержащих малые РНК, на всех стадиях регуляции экспрессии генов.

Основные (“канонические”) биологические активности малых регуляторных РНК.

Способы регуляции экспрессии генов с участием коротких РНК. Подавление и активация транскрипции и трансляции, посттранскрипционная модификация, контроль стабильности и деградации РНК-мишеней.

“Классическая” РНК-интерференция: общая схема.

Индукторы РНК-интерференции – двуцепочечные молекулы РНК: структура, варианты происхождения. РНК-интерференция: первая стадия (dicing), вторая стадия (slicing). Белок Dicer, особенности строения и взаимодействие с кофакторами. Комплекс RISC: компоненты, функции. Расщепление РНК-мишени. “Вторичная” РНК-интерференция. Белки Ago (argonaute): структура и роль на разных стадиях.

МикроРНК – гены, процессинг, механизмы действия.

Общие свойства микроРНК. Особенности микроРНК, отличающие их от siРНК. Разнообразие вариантов взаимодействия микроРНК с мишенями. Гены микроРНК: строение, распределение в геноме, расположение относительно белок-кодирующих генов, особенности транскрипции. Ингибирование трансляции с участием микроРНК. Транскрипция и процессинг микроРНК у животных: ядерная и цитоплазматическая стадии, варианты. Белок Drosha, его функции, взаимодействие с кофакторами.

Варианты образования изоформ микроРНК.

Миртронный путь процессинга микроРНК.

Особенности биогенеза микроРНК и РНК-зависимого сайленсинга у растений.

Мишени для микроРНК в составе мРНК, и белки, взаимодействующие с ними. Зависимость стабильности микроРНК от наличия потенциальной мишени.

РНК-интерференция, противовирусная защита и стабильность генома.

Аппарат РНК-сайленсинга как древнейшая иммунная система. Гонка вооружений между вирусами и их хозяевами с участием РНК-интерференции.

Биологические функции и способы осуществления РНК-зависимого транскрипционного сайленсинга. Транскрипционный сайленсинг с участием малых РНК у S.pombe. Компоненты комплексов RITS и RDRC. РНК-зависимое метилирование ДНК у растений. scnРНК и “диминуция” хроматина у Tetrahymena. Особенности систем РНК-зависимого транскрипционного сайленсинга у растений, млекопитающих, насекомых, дрожжей и нематод.

Борьба с чужеродными последовательностями с участием некодирующих РНК и. регуляция экспрессии генов с участием некодирующих РНК-структур у бактерий. CRISPR-интерференция.

Возможные пути происхождения новых генов, кодирующих регуляторные РНК, участвующие в РНК-сайленсинге. Происхождение коротких регуляторных РНК из длинных некодирующих РНК, интронов, копий мобильных элементов.

Перспективы практического применения РНК-интерференции.

Направления, перспективы и ограничения практического использования РНК-интерференции. РНКi-терапия.

Связь нарушений экспрессии микроРНК с заболеваниями человека. МикроРНК-онкогены и онкосупрессоры. МикроРНК как биомаркеры и мишени для терапии.

Принципы индукции РНК-интерференции in vivo и in vitro. Получение и доставка в клетки РНК-индукторов. Дизайн коротких РНК для индукции РНК-интерференции.

Способы анализа микроРНК. Подходы, используемые для выявления новых микроРНК и их мишеней.

Литература для чтения:

С. В. Разин, А. А. Быстрицкий. Хроматин: упакованный геном. «Бином. Лаборатория знаний». 2009. С. 172

Коряков Д.Е., Жимулев И.Ф. Хромосомы. Структура и функции.
Новосибирск: Изд-во СО РАН, 2009 г., 258 c.

Эпигенетика. ред. Закиян СМ, Власов ВВ, Дементьева ЕВ. Новосибирск: Изд-во СО РАН, 2012, С. 465-479

Эпигенетика под ред. Под редакцией С. Д. Эллиса, Т. Дженювейна, Д. Рейнберга Техносфера, 2010 (рус. Перевод книги D. Allis, T. Jenuwein, D. Reinberg, M.-L. Caparros. Epigenetics. Cold Spring Harbor Laboratory Press. 2007. • 502 pp. ISBN-10: 0879698756